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?藍白斑篩選中IPTG和X-gal的工作原理和使用方法


細菌藍白斑篩選原理:
IPTG為安慰型誘導物,可誘導β-半乳糖苷酶的產生,X-gal是β-半乳糖苷酶的作用底物,在β-半乳糖苷酶的作用下X-gal被切割成半乳糖和深藍色的物質:5-溴-4-靛藍,有色物質可使所在的菌落呈現藍色。
但當含有lac啟動子的質粒中插入了外源基因,則不能產生β-半乳糖苷酶,因此不能分解X-gal產生藍色底物,所在的菌落呈現白色(相對藍色),這樣的菌落才有可能是我們想要的菌株。藍白斑篩選減輕了在篩選陽性克隆菌落時的工作量。
 
使用濃度:
IPTG濃度:50mg/ml;X-gal濃度:20mg/ml
 
直接涂板法:
取IPTG溶液10l,X-gal溶液20l滴在培養基上,同時滴加50~100l無菌水或無菌LB,用涂布棒涂抹均勻,放至表面無水后即可使用。
 
預制板:
倒板時,在溫度降至50℃后。每100mlLB中加入250l的IPTG溶液和500?l的X-gal溶液,混勻后制板即可。
 
注意:
1、X-gal不溶于水,用二甲基甲酰胺(DMF)溶解;
2、X-gal對光敏感,含有X-gal的平板應該避光保存,在1~2周內使用;
3、過夜培養后藍白斑顯示不明顯可將平板放入4℃冰箱中,一段時間后藍白斑顯示會比較明顯,便于挑選。
 
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